Zelluläre Signalübertragung
Die zelluläre Signalübertragung ermöglicht es Zellen, ihre Umgebung wahrzunehmen und ihr Verhalten über biochemische Veränderungen wie Phosphorylierung oder Verschiebungen der Genexpression rasch anzupassen. Diese Signale entstehen typischerweise an der Zellmembran, wo Rezeptoren äußere Reize erkennen und nachgeschaltete Signalwege auslösen.
Das xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) System bietet eine hochempfindliche, markierungsfreie Möglichkeit, diese Signalereignisse zu verfolgen. Durch die Messung von Impedanzänderungen, die durch Zellanheftung, Morphologie und Adhäsionsdynamik entstehen, erfasst xCELLigence sowohl schnelle Reaktionen – innerhalb von Minuten nach Zugabe eines GPCR-Liganden – als auch längerfristige Effekte wie Proliferationsänderungen nach Stimulation mit Wachstumsfaktoren.
Warum xCELLigence für Studien zu Zellsignalwegen einsetzen?
Markierungsfreie Echtzeit-Überwachung unter physiologischen Bedingungen.
Empfindlich gegenüber Veränderungen von Zellzahl, Zellgröße, Morphologie und Adhäsion.
Erfasst sowohl unmittelbare Signalereignisse als auch langfristige funktionelle Reaktionen..
Einfacher Arbeitsablauf mit Hochdurchsatz-Fähigkeit.
Signalübertragung über Membranrezeptoren
Signalübertragung über Membranrezeptoren. Extrazelluläre Reize werden zunächst überwiegend über Membranrezeptoren wahrgenommen. Die Weiterleitung des Signals ins Zellinnere kann zu einer Regulation über biochemische Modifikationen und/oder Veränderungen von Transkription und Translation führen.
Unkomplizierter Arbeitsablauf
Schritt 1: Zellen auf der E-Plate aussäen
Schritt 2: Adhärente Zellen wachsen auf den E-Plate Biosensoren und ermöglichen so eine kontinuierliche, nicht-invasive Messung.
Schritt 3:Die Zellen werden mit GPCR-Agonist/Antagonist, RTK-Ligand/Inhibitor oder Agonist/Antagonist nukleärer Hormonrezeptoren behandelt.
Schritt 4:Das xCELLigence System erfasst die Daten automatisch im CO₂-Inkubator und verfolgt dynamische zelluläre Reaktionen, während sie ablaufen.
GPCR-vermittelte Signalwege
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Familie der Zelloberflächenrezeptoren und sind wichtige therapeutische Zielstrukturen. Werden GPCRs durch unterschiedliche Reize aktiviert, lösen sie nachgeschaltete Signalwege aus, die Zellmorphologie, Adhäsion und Proliferation verändern. Diese Veränderungen lassen sich präzise erfassen mit xCELLigence RTCA und dessen empfindlicher, markierungsfreier Impedanztechnologie.
Anders als klassische GPCR-Assays, die auf konstruierten Reportersystemen oder erzwungener Signalweg-Kopplung beruhen, misst xCELLigence die integrierte zelluläre Antwort direkt in Modellen mit endogen exprimierten Rezeptoren und liefert damit biologisch relevante Ergebnisse. Dieser Echtzeit-Ansatz erfasst sowohl schnelle Signalereignisse als auch längerfristige funktionelle Effekte, verbessert damit die Trefferqualität im Screening und ermöglicht tiefere Einblicke in die Rezeptorpharmakologie.
Wichtigste Vorteile von xCELLigence für GPCR-Studien
Flexibel: Erfasst die Aktivierung über verschiedene GPCR-Familien hinweg.
Breite Abdeckung: Misst die Signalübertragung über Gs-, Gq-, Gi- und G12/13-Wege.
Unvoreingenommene Antwort: Erfasst funktionelle Selektivität und Effekte auf die gesamte Zelle..
Physiologisch relevant: Arbeitet mit Primärzellen, Stammzellen und krankheitsrelevanten Modellen.
Gs-gekoppelte GPCRs:
Stimulation eines Gs-Protein-gekoppelten Rezeptors durch Calcitonin in CHO-K1-Zellen.
Mit Calcitonin stimulierte CHO-K1-Zellen zeigen schnelle, dosisabhängige Impedanzänderungen und ermöglichen so die Bestimmung des EC₅₀.
CHO-K1-Zellen exprimieren endogen den Calcitonin-1a-Rezeptor (C1a). In dieser Studie wurden die Zellen 3 Stunden in 0,5 % FCS gehungert und anschließend mit Calcitonin in Konzentrationen von 5 pM bis 5 µM stimuliert. Die linke Abbildung zeigt die dynamische Antwort der CHO-K1-Zellen auf die Calcitonin-Stimulation. Der EC50 von Calcitonin wurde aus der Dosis-Wirkungs-Kurve mit der RTCA-Software berechnet (rechte Abbildung).
Gi-gekoppelte GPCRs:
Stimulation eines Gi-Protein-gekoppelten Rezeptors durch Serotonin in CHO-K1-Zellen.
Die Aktivierung des endogenen Serotonin-Rezeptors in CHO-K1-Zellen erzeugt unterscheidbare kinetische Signaturen und präzise EC₅₀-Werte.
CHO-K1-Zellen exprimieren endogen den Serotonin-Rezeptor. In dieser Studie wurden die Zellen 3 Stunden in 0,5 % FCS gehungert und anschließend mit Serotonin in Konzentrationen von 1 pM bis 100 µM stimuliert. Die linke Abbildung zeigt die dynamische Antwort der CHO-K1-Zellen auf die Serotonin-Stimulation. Der EC50 von Serotonin wurde aus der Dosis-Wirkungs-Kurve mit der RTCA-Software berechnet (rechte Abbildung).
Nuklearhormon-vermittelte Signalwege
Nukleäre Hormonrezeptoren (NHRs) sind intrazelluläre Transkriptionsfaktoren, die die Genexpression regulieren und eine wesentliche Rolle in der endokrinen Funktion spielen. Da sie in ihrer natürlichen biochemischen Umgebung verbleiben, liefern zellbasierte NHR-Assays physiologisch besonders relevante Erkenntnisse zu Estrogen-, Androgen-, Schilddrüsenhormon- und weiteren Signalwegen – zentralen Angriffspunkten endokrin wirksamer Chemikalien (EDCs).
Herkömmliche NHR-Assays beruhen auf Endpunktmessungen und erfassen die dynamische Natur hormongesteuerter Reaktionen nicht. Das xCELLigence RTCA system überwindet diese Einschränkung: Es ermöglicht eine kontinuierliche, markierungsfreie und nicht-invasive Verfolgung zellulärer Reaktionen und liefert mit einem einfachen, automatisierten Arbeitsablauf umfassendere und aussagekräftigere Daten.
Wichtigste Vorteile des Einsatzes von xCELLigence für NHR-Studien
Der markierungsfreie Ansatz erlaubt den empfindlichen Nachweis endogener Rezeptoraktivität.
Kinetische Antwortprofile können für bestimmte Signalwege diagnostisch sein.
Zytotoxizität und Proliferation lassen sich in einem einzigen Experiment unterscheiden.
Echtzeitdaten, die optimale Readout-Zeitfenster für den Assay sichtbar machen.
Zeitabhängige zelluläre Antworten auf einen Agonisten des Schilddrüsenhormon-Rezeptors
GH3-Zellen aus der Rattenhypophyse, die Schilddrüsenhormon-Rezeptoren (TR) endogen exprimieren, reagieren empfindlich auf eine T3-Stimulation. Die GH3-Zellen wurden auf Agilent E-Plates ausgesät, über Nacht kultiviert und anschließend mit T3 behandelt. Der Cell Index (CI) wurde 96 Stunden lang kontinuierlich aufgezeichnet und auf den Zeitpunkt der Behandlung normalisiert (Pfeil). Unbehandelte Zellen dienten als Negativkontrolle.
Zeitabhängige zelluläre Antworten auf einen Agonisten des Estrogen-Rezeptors
GH3-Zellen aus der Rattenhypophyse reagierten auch deutlich auf den Estrogenrezeptor-(ER-)Agonisten 17β-Estradiol (E2). Nach Kultivierung über Nacht auf Agilent E-Plates wurden die Zellen mit E2 behandelt; der Cell Index (CI) wurde 96 Stunden lang kontinuierlich aufgezeichnet und auf den Behandlungszeitpunkt normalisiert (Pfeil). Unbehandelte Zellen dienten als Negativkontrolle. Der E2-induzierte Anstieg der Proliferation stimmt mit dem zuvor beschriebenen Verhalten der ER-Signalübertragung in GH3-Zellen überein.
Signalübertragung über Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK)
Rezeptor-Tyrosinkinasen steuern viele der wichtigsten zellulären Prozesse des Körpers – und wenn ihre Signalübertragung entgleist, können unter anderem Krebs, Entzündungen und Stoffwechselerkrankungen die Folge sein. Die RTK-Aktivität zu verstehen ist essenziell, doch klassische Assay-Plattformen sind oft langsam, komplex und störanfällig.
Das xCELLigence RTCA System verändert die RTK-Forschung grundlegend – mit einem schnellen, markierungsfreien und wirklich zellbasierten Ansatz. Indem es morphologische Veränderungen, die durch Wachstumsfaktor-Signale ausgelöst werden, in Echtzeit verfolgt, macht xCELLigence die dynamische RTK-Aktivität mit unerreichter Einfachheit und Empfindlichkeit sichtbar.
Warum sich Forschende für xCELLigence bei RTK-Studien entscheiden
Echtzeit-Einblicke in schnelle Signalübertragung und langfristige zelluläre Effekte.
Markierungsfreier, nicht-invasiver Nachweis – ohne Farbstoffe, Reporter oder Assay-Interferenzen.
Endogene Rezeptoraktivität wird direkt in physiologisch relevanten Zellen gemessen.
Optimierte Arbeitsabläufe die den Arbeitsaufwand verringern und die Komplexität des Assays beseitigen.
Kurzzeitantwort einer Rezeptor-Tyrosinkinase
Zellen, die rekombinantes PDGFRβ exprimieren, wurden auf einer E-Plate 96 ausgesät und über Nacht kultiviert, bevor sie unter Serumentzug gesetzt wurden. Anschließend wurden sie steigenden Dosen des PDGF-Inhibitors Imatinib ausgesetzt und danach mit PDGF-BB stimuliert. In der Echtzeit-Überwachung mit xCELLigence bewirkte Imatinib eine deutliche, dosisabhängige Hemmung der PDGF-induzierten morphologischen Veränderungen mit einem IC₅₀ von 135 nM.
Antwort einer Zelllinie mit Rezeptor-Tyrosinkinase-Expression auf einen Inhibitor
Zellen, die konstitutiv aktives cMET exprimieren, wurden auf einer E-Plate 384 ausgesät und mit abgestuften Dosen des cMET-Inhibitors Crizotinib behandelt. Die Echtzeit-Überwachung mit dem xCELLigence System zeigte eine deutliche, dosisabhängige Umkehr des cMET-getriebenen morphologischen Signals mit einem IC₅₀ von 87,5 nM.
Literatur
Application Notes
Dynamic Monitoring of G-Protein‑Coupled Receptor Activation in Living Cells
High-Throughput GPCR Assay Development
GPCR-vermittelte Signalwege
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Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.