Hydroxylradikale in lebenden Zellen in Echtzeit
nachweisen – ROS beobachten:
CytoCHECK SPAchip® OHrad ROS Single-Detection Kit
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) ist der übliche Sammelbegriff für die reaktiven Moleküle und freien Radikale, die aus molekularem Sauerstoff hervorgehen. Zahlreiche Arbeiten haben ihre Botenrolle bei Zellüberleben, Proliferation, Differenzierung, Zelltod, Apoptose und Ferroptose belegt (1,2). Die CytoCHECK SPAchip® Technologie erlaubt eine Oberflächenmodifikation mit einem Fluoreszenzfarbstoff und damit die Beobachtung intrazellulärer ROS in Echtzeit – von der Population bis zur Einzelzelle. CytoCHECK SPAchip® OHrad ROS Single-Detection Kit weist gezielt Hydroxylradikale (•OH) über Änderungen der grünen Fluoreszenzintensität in lebenden Zellen nach. Das Produkt ist zudem so ausgelegt, dass es erst im Kontakt mit intrazellulären Esterasen aktiv wird. Das CytoCHECK SPAchip® OHrad ROS Single- Detection Kit kann nun die Menge intrazellulärer Hydroxylradikale erfassen, ohne dass pH-Änderungen des Mediums das Ergebnis verfälschen; so lässt sich der Verlauf in lebenden Zellen verfolgen, ohne ihren physiologischen oder Stoffwechselzustand über die Zeit zu stören.
ANWENDUNGEN
NEURODEGENERATIVE ERKRANKUNGEN
Wie oxidativer Stress zu neurodegenerativen Erkrankungen beiträgt – einschließlich Neuronenschäden und mitochondrialer Funktionsstörung. Etwa Untersuchungen zur amyotrophen Lateralsklerose (ALS) und zur Rolle der Hydroxylradikale beim Untergang von Motoneuronen.
KREBSTHERAPIEN
Wie Antitumormittel Hydroxylradikale erzeugen und damit apoptotischen Zelltod und Ferroptose auslösen können (1,2). Versuche mit Antioxidantien, die den oxidativen Stress in Krebszellen senken sollen, um herkömmliche Behandlungen wie Chemo- und Strahlentherapie wirksamer zu machen.
HERZ-KREISLAUF-ERKRANKUNGEN
Wie oxidativer Stress und Hydroxylradikale zur Bildung atherosklerotischer Plaques und zur endothelialen Funktionsstörung beitragen. Untersuchungen zu oxidativen Schäden durch die Reperfusion ischämischen Gewebes.
DIABETES UND STOFFWECHSEL
Wie überschüssige Glukose und Stoffwechselstörungen die Bildung von Hydroxylradikalen anstoßen und so zu Folgeerkrankungen des Diabetes beitragen.
ALTERNSFORSCHUNG
Wie oxidativer Stress die Zellalterung und den Verlust biologischer Funktionen im Alter mitverursacht. Arbeiten zum Zusammenhang zwischen oxidativem Stress und Erkrankungen wie Osteoporose und Makuladegeneration.
ENTZÜNDLICHE UND AUTOIMMUNE ERKRANKUNGEN
Untersuchungen dazu, wie ROS – darunter Hydroxylradikale – als Vermittler von Entzündungen wirken und zur Entstehung chronisch entzündlicher und autoimmuner Erkrankungen beitragen.
Intrazelluläre Hydroxylradikale (•OH) beobachten, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in der Fibroblasten-Zelllinie 1095SK nachzuweisen
SPAchip® technology eignet sich gut für die Arbeit im Zellinneren und verbleibt lange im Zytoplasma (3).
CytoCHECK SPAchip® OHrad ROS Kit ist so ausgelegt, dass es AUSSCHLIESSLICH im Kontakt mit intrazellulären Esterasen aktiv wird – das Fluoreszenzsignal stammt also von aufgenommenen SPAchips.
Das CytoCHECK SPAchip® OHrad ROS Single-Detection Kit ist selektiv für Hydroxylradikale (•OH). In Zellen entstehen •OH-Radikale spontan aus H₂O₂ über die von Metallionen katalysierte Fenton- und Haber-Weiss-Reaktion (4). H₂O₂ wiederum bildet die Superoxiddismutase (SOD) aus dem Superoxid-Radikalanion (O2•-). Das Kit misst also •OH-Radikale gleichermaßen, ob sie als primäre ROS oder als Folgeprodukt anderer ROS entstehen.
OHrad ROS SPAchips sind zudem unempfindlich gegen pH-Änderungen (Abb. 1) – Messartefakte durch pH-Schwankungen im Versuchsaufbau entfallen.
Doxorubicin (DOXO), ein Anthracyclin, das wegen seines breiten Wirkspektrums, seiner Wirksamkeit und der Auslösung oxidativen Stresses vielfach gegen bösartige Tumoren eingesetzt wird, führt zu einer übermäßigen Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (5,6). DOXO erzeugt ROS über Redoxzyklen an seiner Semichinon-Struktur (6,7). Wie für die Fenton-Reaktion beschrieben, katalysiert Eisen dabei die Bildung von •OH-Radikalen aus H₂O₂ (7,8).
Wir haben Änderungen der reaktiven Sauerstoffspezies in 1095SK-Fibroblasten mit dem CytoCHECK SPAchip® OHrad ROS Single-Detection Kit untersucht. Zunächst waren aufgenommene OHrad ROS SPAchips im grünen Fluoreszenzkanal in den Fibroblasten zu sehen (Abb. 2). Anschließend wurde die ROS-Konzentration in der Zelllinie 1095SK bestimmt; das SPAchip-Signal hängt dabei von der ROS-Menge ab, die die Zellen abhängig von der Wirkstoffkonzentration bilden (3 und 6 Stunden nach der DOXO-Behandlung) (Abb. 3). Die Fluoreszenzsignale nahmen mit der Wirkstoffkonzentration zu, verglichen mit der Ausgangsbedingung (Abb. 3).
Mit dem CytoCHECK SPAchip® OHrad ROS Single-Detection Kit lässt sich der Verlauf intrazellulärer Hydroxylradikale in lebenden Zellen also einfach verfolgen (etwa in 1095SK-Fibroblasten; Abb. 2), ohne über lange Zeit zytotoxisch zu wirken. Unsere SPAchip-Biosensoren erfassen und messen reaktive Sauerstoffspezies zudem genau, ohne vom pH des Mediums beeinflusst zu werden (Abb. 1).
AUF EINEN BLICK:
- ROS-Sensor: intrazelluläre Aktivierung durch zytosolische Esterasen.
- ROS-Selektivität: Hydroxylradikal (OH).
- pH-unempfindlich.
Abbildung 1: Das CytoCHECK SPAchip® OHrad ROS Single-Detection Kit ist nicht pH-empfindlich.
Der pH hat keinen nennenswerten Einfluss auf die Fluoreszenz der CytoCHECK OHrad ROS SPAchips®.
Abbildung 2:
CytoCHECK SPAchip® OHrad ROS Single- Detection Kit in fibroblast
Zelllinie 1095SK.
Aufnahmen mit intrazellulären ROS SPAchip® in Grün, Objektiv mit 40-facher Vergrößerung. In Blau die Kernfärbung mit Hoechst 33342, in Rot die Zytoplasmafärbung mit Cell Mask™ Plasma Membrane. Maßstabsbalken: 20 µm.
a) CytoCHECK SPAchip® ROS Green 1095sk 3 hours
b)
CytoCHECK SPAchip® ROS Green 1095sk 6 hours
Abbildung 3: Dosis-Wirkungs-Verlauf von Doxorubicin mit dem SPAchip® OHrad ROS Single-Detection Kit in 1095SK-Fibroblasten
Korrigierte Fluoreszenzintensität der an SPAchips gekoppelten ROS-Sonde in der Fibroblasten-Zelllinie 1095SK nach 3 Stunden a) und
6 Stunden b) Behandlung mit unterschiedlichen Doxorubicin-Konzentrationen (DOXO). Die ROS SPAchips zeigen einen Zusammenhang mit der Behandlungskonzentration. Die Balken geben die Mittelwerte je Bedingung an, die Fehlerbalken den Standardfehler des Mittelwerts. Ausreißer wurden mit der ROUT-Methode bestimmt. Statistisch ausgewertet wurde mit einer zweifaktoriellen ANOVA bei einem Alpha von 0,05 (95-%-Konfidenzintervall).
Literatur:
1.Chen Z., Wang W., Abdul Razak SR., Han T., Ahmad NH., & Li X. Ferroptosis as a potential target for cancer therapy. Cell Death Dis. 2023 Jul 24;14(7):460. https://doi.org/10.1038/s41419-023-05930-w.
2.Yu Y., Yan Y., Niu F., Wang Y., Chen X., Su G., Liu Y., Zhao X., Qian L., Liu P., & Xiong Y.. Ferroptosis: a cell death connecting oxidative stress, inflammation and cardiovascular diseases. Cell Death Discov. 2021 Jul
26;7(1):193. https://doi.org/10.1038/s41420-021-00579-w.
3.Torras, N.; Agusil, J. P.; Vázquez, P.; Duch, M.; Hernández-Pinto, A. M.; Samitier, J.; De La Rosa, E. J.; Esteve, J.; Suárez, T.; Pérez-García, L.; Plaza, J. A. Suspended Planar-Array Chips for Molecular Multiplexing at
the Microscale. Advanced Materials 2016, 28 (7), 1449–1454. https://doi.org/10.1002/adma.201504164.
4.Henninger, C.; Fritz, G. Statins in anthracycline-induced cardiotoxicity: Rac and Rho, and the heartbreakers. Cell death & disease, 2018, vol. 8, no 1, p. e2564-e2564. https://doi.org/10.1038/cddis.2016.418. 5.Espinoza, E. M.; Røise, J. J.; Li, I. C.; Das, R.; Murthy, N. Advances in Imaging Reactive Oxygen Species. Journal of Nuclear Medicine 2021, 62 (4), 457–461. https://doi.org/10.2967/jnumed.120.245415. 6.He, H., Wang, L., Qiao, Y., Zhou, Q., Li, H., Chen, S., ... & He, M. Doxorubicin induces endotheliotoxicity and mitochondrial dysfunction via ROS/eNOS/NO pathway. Frontiers in Pharmacology, 2020, vol. 10, p. 1531.
https://doi.org/10.3389/fphar.2019.01531.
7.Štěrba, M., Popelová, O., Vávrová, A., Jirkovský, E., Kovaříková, P., Geršl, V., & Šimůnek, T. Oxidative stress, redox signaling, and metal chelation in anthracycline cardiotoxicity and pharmacological
cardioprotection. Antioxidants & redox signaling, 2013, vol. 18, no 8, p. 899-929. https://doi.org/10.1089/ars.2012.4795.
8.Van Acker, H.; Gielis, J.; Acke, M.; Cools, F.; Cos, P.; Coenye, T. The Role of Reactive Oxygen Species in Antibiotic-Induced Cell Death in Burkholderia Cepacia Complex Bacteria. PLoS One 2016, 11 (7).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159837.
Dynamic Film about cell sensing
