Proliferations- und Apoptose-Assays in Echtzeit
Proliferation und Apoptose durchgehend und markierungsfrei verfolgen, statt einen einzigen Endpunkt zu messen — quantitative, reproduzierbare Daten zu Zellgesundheit und Wirkmechanismus.
Proliferationsassays in Echtzeit
Die Zellproliferation liegt vielen biologischen Vorgängen zugrunde: Sie treibt Wachstum und Gewebereparatur an, und ihre Entgleisung hängt mit Krankheiten wie Autoimmunität und Krebs zusammen. Zugleich dient sie verbreitet als allgemeines Maß für die Zellgesundheit – etwa um eine Virusinfektion nachzuweisen oder die Toxizität eines Wirkstoffs zu beurteilen.
Herkömmliche Proliferationsassays verlangen jedoch viel Handarbeit und liefern nur begrenzte Endpunktdaten.
Die xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) bietet einen umfassenderen Weg, die Proliferation durchgehend und markierungsfrei zu verfolgen.
Die Vorteile
Zellgesundheit und Proliferation unmittelbar und in Echtzeit messen
Quantitative, reproduzierbare Daten
Einfacher Arbeitsablauf mit hohem Durchsatz
Tieferer Einblick in die Wirkmechanismen in der Zelle
Mehrere Blickwinkel auf die Zellgesundheit – für mehr Sicherheit
Herkömmliche Assays liefern nur Momentaufnahmen. Das xCELLigence RTCA eSight verbindet dagegen elektrische Impedanz mit Lebendzell-Bildgebung und liefert einander ergänzende Echtzeit-Angaben zu Zellzahl, Adhäsion und Morphologie – ohne Mehrarbeit. Dieser doppelte Zugang liefert Haupt- und Bestätigungsergebnis im selben Assay.
Application Note: Real-Time Monitoring of Cell Proliferation and Viability
Application Note:Real-Time Monitoring of Apoptotic Cell Death
Impedanz und Lebendzell-Bildgebung im Multiplex
xCELLigence impedance technology erkennt die frühesten Stadien der Proliferation, indem sie Änderungen der Zellanheftung empfindlich misst. Über lange Versuche laufen die bildbasierte prozentuale Konfluenz und der Impedanzverlauf gleich; die Impedanz erkennt und ordnet die Wirkung unterschiedlicher Serumkonzentrationen aber schon in den ersten zehn Stunden – wichtig etwa bei der Herstellung von Zelltherapeutika, wo frühe Qualitätsmerkmale zählen.
Markierungsfreie Verfolgung der Proliferation von HT-1080-Zellen mit dem xCELLigence RTCA eSight. Die oberen Aufnahmen zeigen Anheftung, Ausbreitung und Wachstum über die Zeit, die unteren Diagramme die Proliferationskinetik bei verschiedenen Serumkonzentrationen – als prozentuale Hellfeld-Konfluenz oder als Impedanz. Bemerkenswert: Die Impedanz erkennt und ordnet die serumabhängigen Wirkungen bereits binnen zehn Stunden und liefert damit einen sehr empfindlichen frühen Messwert.
Verfolgung der HT-1080-Proliferation mit kernständigen fluoreszierenden eLive-Farbstoffen, um tatsächliche Zellzahlen zu erhalten. Die oberen Aufnahmen zeigen Zellen, die mit eLive Red oder eLive Green markiert sind; die eSight-Maskierung (rechte Felder) umreisst jeden Zellkern. Unten: (links) Proliferationskurven aus fluoreszenzbasierten Zellzahlen, (Mitte) Vergleich der Hellfeld-Konfluenz mit und ohne eLive-Farbstoffe, (rechts) impedanzbasierte Proliferationskinetik. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung über zwölf Parallelansaetze an.
Proliferation über tatsächliche Zellzahlen verfolgen – mit farbstoffmarkierten Zellkernen
Agilent eLive Red und eLive Green ermöglichen das unmittelbare Zählen von Zellen am eSight. Im Kulturmedium erzeugen diese Farbstoffe nur geringe Hintergrundfluoreszenz, steigen beim Binden an die Kern-DNA aber um mehr als das Tausendfache – so lassen sich Zellkerne genau und ohne Störung zählen, auch über mehrere Tage.
Proliferation über tatsächliche Zellzahlen verfolgen – mit proteinmarkierten Zellkernen
Stabil fluoreszierende Zelllinien lassen sich mit den lentiviralen Reagenzien eLenti Red, eLenti Green, and eLenti Blue erzeugen. Sie fuegen sich ins Wirtsgenom ein und lassen über einen EF1α-Promotor kernständiges mKate, EGFP oder TagBFP exprimieren. Die eSight-Bildgebung zeigt klar abgegrenzte Zellkerne – mit oder ohne automatische Fluoreszenzmaskierung.
Verfolgung der Zellproliferation mit kernständigem Fluoreszenzprotein zur Bestimmung tatsächlicher Zellzahlen. Beispielaufnahmen von HEK-293-, MDCK- und MDA-MB-231-Zellen, transduziert mit Agilent eLenti Red, eLenti Green beziehungsweise eLenti Blue.
Bildbasierte Verfolgung der Proliferation einzelner Zelltypen in einer gemischten Population. (A) Links: Aufnahme EGFP-exprimierender A549-Zellen, gemischt mit mKate-exprimierenden HT1080-Zellen. Rechts: dasselbe Bild mit eSight-Fluoreszenzmaskierung der Zellkerne (gelbe Umrandung um grüne, türkise um rote Kerne). (B) Proliferation der A549- und HT1080-Zellen in dieser Kokultur. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung über 96 Parallelansaetze an.
Proliferation in gemischten Zellpopulationen untersuchen
In einem Beispiel einer Mischkultur wurden EGFP-markierte A549-Zellen und mKate-markierte HT-1080-Zellen im Verhältnis 1:1 ausgesät. Mit getrennten roten und grünen Kernmasken zeigte der eSight den Wachstumsvorsprung der HT-1080-Zellen genau an. Dasselbe Verfahren lässt sich auf Untersuchungen zur Tumormikroumgebung, auf Kokulturen und auf die Abtötung durch Immunzellen anwenden.
Literatur
Monitoring Cell Proliferation in Real Time Using the xCELLigence RTCA eSight
Real-Time and Dynamic Monitoring of Cell Proliferation and Viability for Adherent Cells
Combining Live Cell Imaging with Cellular Impedance to Monitor Apoptotic Cell Death in Real Time
Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.