Stimulation von Immunzellen
Umfassende Zytokinprofile nach Stimulation von PBMC – am NovoCyte Penteon mit Bead-basierten Multiplex-Assays.
Umfassende Beurteilung der Zytokinproduktion am NovoCyte Penteon
Wer Immunantworten auf Erreger, Autoimmunvorgänge oder neue Therapeutika beurteilen will, muss die Zytokinproduktion verstehen.
Diese Application Note zeigt, wie sich mit dem NovoCyte Penteon flow cytometer in Verbindung mit BioLegend LEGENDplex bead-based multiplex assays ein umfassendes Zytokinprofil erstellen lässt.
In dieser Untersuchung wurden PBMC von zwei Spendern entweder mit αCD3-Antikörper (gegen T-Zellen gerichtet) oder mit LPS (das Monozyten aktiviert) stimuliert. Die Zytokinausschüttung wurde mit den BioLegend LEGENDplex COVID-19 Cytokine Storm Panels 1 und 2 am NovoCyte Penteon gemessen; 27 Zytokine wurden quantifiziert. Zusätzlich hat die intrazelluläre Zytokinfärbung zusammen mit Oberflächenmarkern gezeigt, welche Zellen IL-2, IFN-γ und TNFα bilden: T-Zellen, NK-Zellen und Monozyten.
Die wichtigsten Ergebnisse
27 Zytokine quantifiziert mit den LEGENDplex COVID-19 Cytokine Storm Panels 1 und 2 – ein breites Bild der Immunaktivierung.
Die intrazelluläre Zytokinfärbung zeigte, wie häufig die Zytokine gebildet werden und welcher Zelltyp dafür verantwortlich ist (T-Zellen, NK-Zellen, Monozyten, B-Zellen).
Die Stimulation mit αCD3 löste eine kräftige, von T-Zellen getragene Zytokinausschüttung aus (etwa IL-2, IFN-γ, TNFα, IL-13, IL-4, GM-CSF), während die Stimulation mit LPS Zytokine aus Monozyten und Makrophagen hervorrief (etwa IL-6, IL-1β, IL-18, G-CSF, CCL2, CCL4) – mit jeweils eigener Signatur.
Die Verbindung von Quantifizierung an Beads mit intrazellulärer Färbung liefert beides: ein quantitatives Zytokinprofil und die Zuordnung zum Zelltyp.
Abbildung 1. Gating-Strategie für die zelltypbezogene Zytokinproduktion. Die Gating-Hierarchie gehört zum Panel aus Tabelle 1. Isolierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) wurden mit LPS stimuliert oder auf eine mit anti-CD3-Antikörper beschichtete Platte gegeben und 15 Stunden lang unter Zugabe von Brefeldin A kultiviert. Das gezeigte Beispiel wurde mit CD3-Antikörper stimuliert. Anschließend wurden die Zellen mit dem Antikörperpanel gefärbt und am NovoCyte Penteon gemessen.
Abbildung 4. Beurteilung der Ausschüttung von 27 Zytokinen mit den LEGENDplex COVID-19 Cytokine Storm Panels 1 und 2. Isolierte PBMC wurden mit LPS (1 ng/ml), einer PBS-Kontrolle oder mit αCD3- beziehungsweise IgG-beschichteten Mikrotiterplatten (1 µg/ml) stimuliert. Der Überstand wurde 24 und 48 Stunden nach der Stimulation abgenommen. Die Zytokinproduktion wurde mit den LEGENDplex COVID-19 Cytokine Storm Panels 1 und 2 quantifiziert. Aufgetragen ist die vielfache Änderung der ausgeschütteten Konzentration: αCD3 gegen IgG-Kontrolle (grau) und LPS gegen PBS-Kontrolle (grün). Proben oberhalb der Nachweisgrenze wurden auf den höchsten Wert der Standardkurve gesetzt, damit sich die vielfache Änderung weiterhin berechnen lässt.
Fazit
Der NovoCyte Penteon zusammen mit LEGENDplex bietet einen leistungsfähigen, hochempfindlichen Ablauf für die eingehende Beschreibung von Immunantworten – hilfreich für die Forschung an Infektionen, an Zytokinstürmen (etwa bei COVID-19) und an der Sicherheit von Therapeutika.Dieses doppelte Vorgehen erlaubt ein breites, unvoreingenommenes Zytokinprofil und benennt zugleich die Zellen, die es hervorbringen. So lassen sich Immunantworten besser beurteilen und Risiken wie ein Zytokinsturm eher abwenden.
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