Kardiotoxizität in Echtzeit an hiPSC-Kardiomyozyten

Kardiale Liabilität zählt zu den häufigsten Ursachen für das Scheitern von Wirkstoffentwicklungen in späten Phasen; auf Kardiotoxizität entfiel etwa ein Drittel der Marktrücknahmen von Arzneimitteln zwischen 1990 und 2006. Herkömmliche präklinische Modelle besitzen häufig eine zu geringe Vorhersagekraft, sodass bereits früh in der Wirkstoffforschung physiologisch relevante Screening-Systeme benötigt werden.

Kardiomyozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC-CMs) bieten eine robuste Plattform, um arzneimittelinduzierte Kardiotoxizität und proarrhythmisches Risiko zu bewerten.

Das xCELLigence RTCA CardioECR system ermöglicht die multiplexe Erfassung von kontraktiler Aktivität, elektrischer Funktion und Zellvitalität in einem einzigen, empfindlichen Assay – so lassen sich kardiotoxische Risiken früher und genauer erkennen.

Application Note:
Real-time analysis for cardiac safety and toxicity assessment

Die bisherigen Methoden zur Bewertung der kontraktilen Aktivität, etwa Langendorff-Herzassays und andere Ex-vivo-Assays am ganzen Organ, sind arbeitsintensiv, durchsatzschwach und teuer. Alternativ lassen sich Tierstudien durchführen; deren Vorhersagekraft und die Übertragbarkeit auf den Menschen sind jedoch stets kritisch zu prüfen – zusätzlich zu den ethischen Aspekten der Tiernutzung. Die funktionelle Überwachung der Kardiomyozyten-Kontraktilität über ein Impedanz-Auslesen (siehe Abbildung links) liefert aussagekräftige Informationen über die Wirkung von Substanzen auf den kontraktilen Apparat.

Fallbeispiel: Blebbistatin, ein Inhibitor der schweren Myosinkette, entkoppelt Erregung und Kontraktionskopplung

Blebbistatin verringerte die Schlagamplitude dosisabhängig, veränderte das Feldpotenzialsignal jedoch selbst nach Exposition gegenüber 10 µM Blebbistatin nicht.

(A) 5 Sekunden Schlagamplituden-Kurven von iCell Kardiomyozyten vor (schwarze Kurven) und nach (rote Kurven) Blebbistatin-Behandlung mit 0,01 µM, 1 µM und 10 µM. Die Substanzzugabe erfolgte mit einer Dosis pro Well.

(B) 5 Sekunden FP-Kurven, aufgezeichnet vor (schwarze Kurve) und nach Behandlung mit 10 µM Blebbistatin.

Bewertung akuter und langfristiger Ionenkanal-Toxizitäten

Assays, die mögliche proarrhythmische Effekte von Substanzen direkter erfassen, arbeiten mit ganzen Tierherzen oder Purkinje-Fasern und sind auf die Bestimmung der Aktionspotenzialdauer ausgelegt. Diese Assays gelten zwar als aussagekräftiger für Arrhythmien, weisen aber eine höhere Rate negativer Vorhersagen auf und können durchsatzschwach und technisch anspruchsvoll sein. Humane iPSC-CMs stellen ein physiologisch relevantes Modell bereit, mit dem sich die potenzielle Toxizität pharmazeutischer Substanzen bzw. die integrierte Ionenkanalaktivität bewerten lässt.

Na+-Kanal

Mexiletin, ein Na+-Kanalblocker, führte zu einer Verringerung des Feldpotenzial-Spikes (FP), was auf eine Blockade des Natriumkanals hinweist.

5 Sekunden Impedanzsignale (IMP) (A) und Feldpotenzialsignale (FP) (B) von iCell CMs vor (schwarze Kurven) und nach (rote Kurven) Exposition gegenüber 10 µM Mexiletin. Aus den IMP- und FP-Rohkurven wurden anschließend gemittelte Einzelwellenformen berechnet (C und D).

Ca2+-Kanäle

Isradipin, ein Ca2+-Kanalblocker, führte zu einer Verkürzung der Feldpotenzialdauer (FPD) und zu einer Abnahme der IMP-Amplitude/Schlagamplitude (BAmp).

5 Sekunden Impedanzsignale (IMP) (A) und Feldpotenzialsignale (FP) (B) von iCell Kardiomyozyten vor (schwarze Kurven) und nach (rote Kurven) Exposition gegenüber 0,01 µM Isradipin. Aus den IMP- und FP-Rohkurven wurden anschließend gemittelte Einzelwellenformen berechnet (C und D).

hERG-Kanal

E4031, ein hERG-Kanalblocker, erzeugte ein EAD-artiges FP-Signal und arrhythmisches Schlagen in den Schlagamplituden-Kurven.

5 Sekunden Impedanzsignale (Schlagamplitude) (A) und Feldpotenzialsignale (FP) (B) von iCell Kardiomyozyten vor (schwarze Kurven) und nach (rote Kurven) Exposition gegenüber 0,03 µM E4031. Überlagerung der IMP- und FP-Kurven (C) 30 min nach Substanzzugabe.

Multi-Ionenkanal

Flecainid: ein Multikanalblocker, der Na+- und hERG-Kanäle hemmt. Flecainid führte in den FP-Kurven zu einer Verringerung des FP-Spikes und zu EAD-artigen Ereignissen (Notch und ektope Schläge) sowie in den IMP-Kurven zu arrhythmischem Schlagen.

5 Sekunden Impedanzsignale (IMP) (A) und Feldpotenzialsignale (FP) (B) von iCell Kardiomyozyten vor (schwarze Kurven) und nach (rote Kurven) Exposition gegenüber 3 µM Flecainid. (C) Überlagerung der IMP- und FP-Kurven 30 min nach Substanzzugabe. (D) Vergrößerter Ausschnitt der FP-Kurve.

Pentamidin, ein Inhibitor des hERG-Kanal-Traffickings, zeigte eine verlängerte FPD und Kontraktilitäts-Periodendauer.

((A) 15 Sekunden IMP-Kurven von iCell Kardiomyozyten vor und nach Pentamidin-Behandlung zu den angegebenen Zeitpunkten.

(B) Die gespreizten FP-Kurven, aufgezeichnet vor und nach Behandlung mit 10 µM Pentamidin zu den angegebenen Zeitpunkten.

(C) Zeitverlauf der FPD-Messung während der Behandlung mit 10 µM Pentamidin.

Bewertung der Anthrazyklin-Toxizität

Doxorubicin, ein Anthrazyklin und Chemotherapeutikum, verursacht bekanntermaßen Kardiotoxizität.

(A) Veränderung des Overall Cell Index über den Verlauf der 72-stündigen Behandlung.

(B) 15 Sekunden Impedanzkurven von iCell Kardiomyozyten vor und nach Doxorubicin-Behandlung zu den angegebenen Zeitpunkten.

Doxorubicin führte dosis- und zeitabhängig zu einer Abnahme des Overall Cell Index, was auf einen Verlust der Zellvitalität und/oder eine strukturelle Schädigung der Zellen hinweist.

Doxorubicin beeinflusste zudem die Kontraktilität der Kardiomyozyten dosis- und zeitabhängig, was mit dem Vitalitätsverlust zusammenhängen kann.

Bewertung der Kinaseinhibitor-Toxizität

Sorafenib ist eine gut untersuchte kardiotoxische Substanz, die bekanntermaßen Myokardinfarkt und Ischämie verursacht.

Sorafenib führte dosis- und zeitabhängig zu einer Abnahme des Overall Cell Index. Bei 20 µM verursachte es Quieszenz der Zellen.

(A) Veränderung des Overall Cell Index über den Verlauf der 48-stündigen Behandlung.

(B) 15 Sekunden Impedanzkurven von iCell Kardiomyozyten vor und nach Sorafenib-Behandlung zu den angegebenen Zeitpunkten.