MSC-Qualitätskontrolle ohne Markierung
Spendervariabilität und der Rückgang über Passagen sind schwer rechtzeitig zu erkennen. xCELLigence RTCA charakterisiert mesenchymale Stammzellen funktionell und markierungsfrei, ab 1.100 Zellen pro Well.
Stammzellen überwachen
Die Expansion mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark (BMSC) für klinische Studien bringt zentrale Schwierigkeiten mit sich:
- Spendervariabilität: Funktionelle Unterschiede zwischen Chargen verschiedener Spender.
- Abnahme mit der Passagenzahl: Verringertes Proliferations- und Differenzierungspotenzial nach mehreren Passagen.
- Fehlende schnelle Assays: Nur wenige Verfahren liefern funktionelle Charakterisierung und Qualitätsbewertung zugleich – einschließlich Vitalität, Reinheit und Potency.
Vorteile von xCELLigence RTCA für die funktionelle Überwachung von MSC
Empfindlicher Nachweis der Morphologie:Kleinste Veränderungen der Zellmorphologie nachweisen, die durch ligandenabhängige GPCR-Aktivierung ausgelöst werden.
Höhere Ausbeute mit weniger Zellen:Benötigt nur wenige Zellen (≥1.100 je Well) für Ergebnisse in wenigen Tagen – oder 10.000 bis 20.000 Zellen je Well, wenn es schneller gehen soll.
Bessere funktionelle Vorhersage: Den funktionellen Zustand undifferenzierter und differenzierter BMSC rasch unterscheiden.
Überblick über den GPCR-Stimulationsassay
Bei Erreichen der Subkonfluenz werden die BMSC mit bestimmten GPCR-Agonisten stimuliert (blauer Pfeil); die Zellantwort wird vom xCELLigence-System erfasst. (B) Die Stimulationsantwort aus (A) im Ausschnitt (gepunkteter Rahmen). Der Zellindex wurde auf den Zellindex zum Behandlungszeitpunkt normiert (NCI). Das Antwortfenster ergibt sich aus dem maximalen NCI (NCImax) nach der Behandlung zu einem gegebenen Zeitpunkt, geteilt durch den NCI der Negativkontrolle (NCInegcntl) zum selben Zeitpunkt.
Application Note: Functional Assessment of Mesenchymal Stem Cells
Beispiel eines Wachstumsprofils von BMSC, aufgezeichnet mit xCELLigence.Unterschiedliche GPCR-Profile undifferenzierter und differenzierter BMSC erlauben eine schnelle Vorhersage des funktionellen Zustands.
BMSC mehrerer Spender wurden über zwölf Passagen expandiert. Bei ausgewählten Passagen wurden kleine Zellproben auf E-Plates ausgesät, adipogen induziert und mit xCELLigence verfolgt, um die funktionelle Leistungsfähigkeit in Echtzeit zu beobachten.
GPCR-Signaturen als schnelle QC-Marker
BMSC zeigen unterscheidbare GPCR-Aktivitätsprofile, die sich für eine schnelle und verlässliche Qualitätskontrolle nutzen lassen. Mit dem GPCR-Stimulationsassay auf xCELLigence können Sie:
- die GPCR-Ansprechbarkeit als unmittelbares Maß für die funktionelle Unversehrtheit der MSC beurteilen
- Qualitätsprüfungen ohne Bruch in die Zellexpansion einfügen
- mit wenigen Zellen auskommen (≥1.100 Zellen je Well in 96-Well-Platten)
- belastbare Ergebnisse in wenigen Tagen erhalten – bei höherer Zelldichte (10.000 bis 20.000 Zellen je Well) schon nach 48 Stunden
Quantitativer Zusammenhang
Die Aktivierung der Rezeptoren A1AR, P2Y1 und H1 hängt mit der adipogenen Differenzierungsfähigkeit zusammen. Daraus ergibt sich ein schneller, vorhersagender Messwert für Qualität und funktionelle Unversehrtheit der MSC.
- Zellen früher Passagen: starke GPCR-Signale und hohes Differenzierungspotenzial
- Spätere Passagen: geringere Rezeptoraktivität und nachlassende Potency
Abbildung. Ergebnisse für Spender 2 (A–I). 24 Stunden nach der adipogenen Induktion wurden die Agonisten CYM5541 und SEW 2871 zur undifferenzierten Kontrolle (A, D) oder zu adipogen induzierten BMSC früher (B, E) beziehungsweise später Passage (C, F) gegeben, um die GPCR S1P3 und S1P1 zu stimulieren. Nach 14 Tagen im adipogenen Differenzierungsmedium wurden die Zellen mit LipidTox Green Lipid Stain angefärbt (G–I).
Stammzell-Qualitätskontrolle einfach und vorhersagend
Die Herstellung mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark (BMSC) im großen Maßstab für den klinischen Einsatz verlangt umfangreiche In-vitro-Expansion und wiederholte Funktionsprüfungen. Dabei stehen meist im Weg:
- Unterschiede von Spender zu Spender, die die Leistung der Zellen beeinflussen
- Nachlassende funktionelle Leistungsfähigkeit mit steigender Passagenzahl
- Fehlende schnelle, quantitative Assays die Vitalität, Reinheit und Potency in einem Arbeitsgang erfassen
Vorteile von xCELLigence RTCA für Qualitätskontrolle und funktionelle Bewertung von MSC
Chargen gleichmäßig halten indem Zellzahl, Anheftung und Morphologie zusammen verfolgt werden.
Ausbeute erhöhen weil weniger Zellen nötig sind und zu jedem Zeitpunkt der Differenzierung gemessen werden kann.
Die funktionelle Leistungsfähigkeit genauer vorhersagen, besser als mit herkömmlichen Verfahren.
Quantitative Kennzahlen für eine belastbare MSC-Charakterisierung
Die Wachstumskurven von xCELLigence RTCA liefern mehrere aussagekräftige Kennzahlen:
- CImax – maximaler Zellindex
- GT50 – Zeit bis zum Erreichen von 50 % des CImax
- CIDT – Verdopplungszeit des Zellindex im logarithmischen Wachstum
Diese Kennzahlen ergeben ein durchgehend quantitatives Bild von Qualität und Leistung der MSC.
Application Note: Quality Control and Functional Assessment of Mesenchymal Stem Cells
Qualitätskontrolle über Spender und Passagen hinweg
Mit xCELLigence RTCA wurden BMSC verschiedener Spender über zwölf Passagen in xenofreien Medien verfolgt.
Zentraler Befund:
Die Wachstumsprofile in Echtzeit zeigten deutliche Unterschiede im Proliferationspotenzial zwischen den Spendern – klar erkennbar in den Passagen 2, 6 und 10.
Das zeigt, dass sich nachlassende Funktion und Spenderunterschiede damit früh und verlässlich erkennen lassen.
Wachstumsprofile in Echtzeit von BMSC dreier Spender über zwölf Passagen zeigen deutliche spenderabhängige Unterschiede im Proliferationspotenzial. Dargestellt sind beispielhafte kinetische Kurven der Passagen 2 (A), 6 (B) und 10 (C); die Zellen wurden auf E-Plates ausgesät und zehn Tage lang verfolgt.
Quantitativer Zusammenhang mit dem Differenzierungspotenzial
Die GPCR-Aktivierung durch Agonisten der Rezeptoren A1AR, P2Y1 und H1 hängt eng mit dem adipogenen Differenzierungspotenzial zusammen:
- Zellen früher Passagen (hohe funktionelle Leistungsfähigkeit) zeigen starke GPCR-Signale und ausgeprägte Rezeptorexpression.
- Zellen mittlerer bis später Passagen zeigen eine schwächere GPCR-Aktivierung, je näher sie der Seneszenz kommen – im Gleichlauf mit dem nachlassenden Differenzierungspotenzial.
Dieser messbare Zusammenhang ergibt ein schnelles, vorhersagendes und quantitatives Verfahren, um die Potency von MSC zu beurteilen – lange bevor herkömmliche Endpunktassays das können.
Die Echtzeitanalyse von BMSC der Spender 2 und 3 zeigt eine deutliche Abnahme der Funktion mit steigender Passagenzahl. Die Wachstumskurven früher gegen späte Passagen (A, G) belegen die nachlassende Proliferationsfähigkeit. Quantitative Kennzahlen wie die Verdopplung des Zellindex (B, H) und phänotypische Markerprofile (E, K) zeigen, wann die Zellen zuvor festgelegte Schwellen für den Funktionsverlust überschreiten.
Stammzell-Differenzierung
Die Differenzierung von Stammzellen zu spezialisierten somatischen Zellen verlangt abgestimmte Veränderungen von Morphologie, Stoffwechsel, Membranpotenzial und Ansprechbarkeit der Zelle. Mit der Echtzeit-Zellanalyse von xCELLigence lassen sich diese Veränderungen durchgehend verfolgen und quantifizieren – ohne Markierung und ohne störende Zwischenschritte.
Warum xCELLigence für Untersuchungen zur Stammzell-Differenzierung?
Kinetische Einblicke in Echtzeit in den gesamten Differenzierungsverlauf.
Ohne Markierung und ohne Eingriff, Fixierung und Färbung entfallen.
Unmittelbarer Abgleich der impedanzbasierten Messwerte mit der Lebendbildgebung auf der E-Plate VIEW.
Empfindlicher Nachweis feiner phänotypischer und funktioneller Veränderungen während der Linienfestlegung.
Die Differenzierung von Myoblasten verfolgen
Humane Myoblasten aus primären Satellitenzellen wurden auf einer E-Plate L8 ausgesät (20.000 Zellen je Well). Nach dem Wechsel auf serumarmes Differenzierungsmedium (50 Stunden nach dem Aussäen) verfolgte xCELLigence durchgehend die Fusion der Myoblasten und die Bildung reifer Myotuben.
Abbildungen mit freundlicher Genehmigung von Dr. Andrea Domenighetti, Northwestern University.
Literatur
Application Notes
Real-Time Quality Control and Functional Assessment of Mesenchymal Stem Cells for Cellular Therapies
Publikationen:
Stammzellen überwachen / Stammzell-Qualitätskontrolle
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Stammzell-Differenzierung
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Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.