PCR & qPCR in der Gendiagnostik

Wann und Wo?

Datum: Di.: bis Do.: 12. bis 14. November 2024.

Dauer: 3 Tage - Dienstag bis Donnerstag

Zeit: 9:00 Uhr bis 16:30 Uhr

Ort: Bremen

Einführung

"Es war einmal ... " 2010 kam eine Studentin auf mich zu und fragte, ob wir auch Lactose-Intoleranz bestimmen könnten: "Nein wir dürfen es nicht, aber Du kannst es selber machen" war meine Antwort. Das Ergebnis war eine sehr schöne kleine und interessante Abschluss-Arbeit über die molekularbiologische Diagnostik der Lactose-Intoleranz. In den Jahren danach, tauchte das Thema in meiner Gendiagnostik-Vorlesung in Zweibrücken auf, und wurde ein Thema mit vielen interessanten Facetten. Lactose-Intoleranz ist verbunden mit Polymorphismen in dem Enhancer-Bereich ca. 14 kbp vor dem LCT-Gen, man kann sie auf verschiedene Weisen nachweisen und das wird der rote Faden des Kurses sein.

Lernziele

Der Schwerpunkt des Kurses liegt auf der Gen-Diagnostik im humanmedizinischen und veterinärmedizinischen Bereich. Sie erlernen die Grundlagen und speziellen Anforderungen einer gendiagnostischen Analyse mittels PCR und real-time PCR in der Labordiagnostik und Labormedizin. Am Beispiel der Laktose-Intoleranz-Detektion beim Menschen, entwickeln wir gemeinsam eine Gen-Diagnostik von der Sequenz-Suche und Analyse, designen Primer/Sonden und schauen uns weitere Methoden an mit denen wir SNPs (single nucleotide polymorphism) analysieren können. Wir interpretieren unsere Ergebnisse diskutieren das Troubleshooting und besprechen die Methodenvalidierung unseres Assays.

Zielgruppe

Gut zu wissen:

• Sie benötigen keine Kenntnisse in real-time PCR, Grundkenntnisse bzgl. DNA/RNA und klassischer PCR sind von Vorteil, können aber auch auf unserer Lernplattform wiederholt werden. Die Zugangsdaten für den Vorkurs erhalten Sie nach der Kurs-Anmeldung.
• Wenn Sie unsicher sind, ob der Kurs das Richtige für Sie ist fragen sie uns.
• Wir arbeiten mit unserem eigenen real-time Cycler der neuesten Generation von BMS und einem zweiten Leihgerät mit Unterstützung von Biozym.
• Wir arbeiten mit FAST-PCR-Reagenzien, was es uns erlaubt ein Experiment in ca.: einer Stunde durchzuführen, um zeitnah die Ergebnisse mit ihnen zu diskutieren.
• Einzelne Begriffe hab ich Ihnen verlinkt auf unsere Wissensdatenbank.

"It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material." (Watson and Crick. Nature 171: 737-738 (1953)).

Praxisteil I (Sequenzsuche, Primer-Design, DNA-Präparation, erstes PCR)

• Wie finde ich die Zielsequenzen und was ist OMIM?
• Wie finde ich die Mutationen vor allem die Sequenzen davor und dahinter für mein PCR?
• Schnelles Primer-Design: Mit Primer3plus, zeige ich ihnen ein online Tool, das ihnen jederzeit im Netz zur Verfügung steht
• Wie kann ich im Labor mal schnell eine DNA präparieren die sauber genug für ein PCR ist?
• DNA-Präparation und das erste PCR.

Praxisteil II (Restriktionsspaltung, Amplikon-Isolation, Vorbereitung für die Sequenzierung)

• Wir versuchen die Mutation mittels Restriktionsspaltung und einer Gelelektrophorese zu identifizieren
• Und bereiten das Amplikon für eine DNA-Sequenzierung vor, das Ganze wird verschickt, außer Haus sequenziert und wir schauen uns die Ergebnisse in der Nachbereitung an .

Praxisteil III (real-time PCR-Tag)

• Wie machen eine SYBR-Green/Eva-Green real-time PCR und schauen uns die Schmelzkurven an.
• Dabei werde ich Ihnen Ct-Wert, BasislinieThreshold u. a. m. erklären
• Im zweiten Teil gibt es eine Amplifikation mit einer Taqman-Sonde und schauen uns auch dort die Schmelzkurve an

Theorieteil

• Informations-Recherche zu Genen des Menschen
• Weitere Methoden in Kürze: MLPA, STR-Fingerprints, Insdel, SSCP, NGS

Nachbesprechung

• Zusätzlich biete ich eine gemeinsame Online-Fragestunde für Troubleshooting oder weitergehende Fragen an. Die Fragestunde wird mit GoTo-Meeting durchgeführt.

Lernplattform

Eine Lernplattform (Moodle, e-learning4science.com) hält für Sie:

• das Script als PDF,
• Versuchsbeschreibungen
• Literatur-Links-Downloads bereit.